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1. 再試一次反應(yīng)，你可能遺漏了一些東西。
2. 檢查聚合酶緩沖液是否已完全解凍并充分混合。
3. 檢查引物是否稀釋到正確的濃度。
4. 配制新的 dNTP 溶液。dNTPs 可以被反復(fù)凍融破壞。
5. 重新制作模板 DNA，尤其是在處理基因組 DNA 時(shí)。舊庫(kù)存可能會(huì)退化或被剪掉。
6. 使用不同的聚合酶。如果使用校對(duì)聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增有問題，我經(jīng)常嘗試使用良好的舊 Taq，這通�？梢越鉀Q問題。不過請(qǐng)記住對(duì)插入片段進(jìn)行排序——如果幸運(yùn)的話，不會(huì)有任何重大突變，您可以按原樣使用插入片段。否則，使用 Taq 和 1/10 濃度的校對(duì)酶的混合物重新進(jìn)行 儀器，您仍應(yīng)獲得相同的擴(kuò)增，但錯(cuò)誤率較低。
7. 改變退火溫度。如果退火溫度太高，您顯然不會(huì)按照您想要的順序進(jìn)行任何啟動(dòng)。另一方面，太低的退火溫度會(huì)導(dǎo)致這種非特異性引發(fā)，不允許出現(xiàn)特定條帶。找到溫度的方法是使用梯度循環(huán)儀并以 1oC 的增量測(cè)試從引物 Tm 到低于 10oC 的范圍。
8. 嘗試不同模板濃度的反應(yīng)。您的模板濃度可能太低或制備中的雜質(zhì)濃度可能太高。在 50 微升反應(yīng)中嘗試 5-10 次平行反應(yīng)，濃度為 10 到 200 ng。
9. 檢查 儀器 儀——溫度和時(shí)間是否符合您的預(yù)期？
10. 在另一臺(tái)循環(huán)儀中嘗試反應(yīng)——您使用的循環(huán)儀的校準(zhǔn)可能已關(guān)閉。
11.嘗試添加劑。我發(fā)現(xiàn) DMSO 在有問題的擴(kuò)增中特別有用。
12.重新設(shè)計(jì)引物——盡量遵守指南。

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