- 概要
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黃曲霉毒素是一類真菌（如黃曲霉和寄生曲霉）的有毒的代謝產(chǎn)物，它們具有很強(qiáng)的致癌性. 黃曲霉毒素M<蘇b>1是黃曲霉毒素B<蘇b>1的代謝產(chǎn)物。經(jīng)攝入含有黃曲霉毒素B<蘇b>1飼料的奶牛產(chǎn)出的牛奶中，其中便含有黃曲霉毒素M<蘇b>1。由于黃曲霉毒素M<蘇b>1相當(dāng)穩(wěn)定，巴氏滅菌法也無(wú)法將其殺滅，所以檢測(cè)黃曲霉毒素M<蘇b>1不僅要在飼料原料中檢測(cè)，而且在終產(chǎn)品中的含量也需要進(jìn)行測(cè)定。用iELisa 黃曲霉毒素M<蘇b>1快速檢測(cè)試劑盒可以準(zhǔn)確地檢測(cè)牛奶、酸奶、奶酪和奶粉中的黃曲霉毒素 M<蘇b>1。
- 原理
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本產(chǎn)品是利用抗體-抗原免疫反應(yīng)檢測(cè)原理建立的一種定量檢測(cè)試劑盒。加入黃曲霉毒素M<蘇b>1（AFLA M<蘇b>1）標(biāo)準(zhǔn)品或樣品后，黃曲霉毒素M<蘇b>1與微孔中的抗體相結(jié)合。洗去沒有結(jié)合的黃曲霉毒素M<蘇b>1，加入酶標(biāo)抗原，與黃曲霉毒素M<蘇b>1與抗體沒有結(jié)合的部位相結(jié)合。洗去沒有結(jié)合的酶標(biāo)抗原，加入TMB底物顯藍(lán)色，加入終止液后顏色由藍(lán)變黃，用酶標(biāo)儀在450nm處檢測(cè)，吸光值與樣品中黃曲霉毒素M<蘇b>1含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出黃曲霉毒素M<蘇b>1的含量。
3. 試劑盒的組成
- 包被有抗體的96微孔板：1塊（96 孔，12 條×8 孔）
- AFM1標(biāo)準(zhǔn)品：0 ng/mL 、0.05 ng/mL、0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL：
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1 瓶 × 1.0mL
- AF-M1酶標(biāo)抗原： 1 瓶 × 15mL
- 10× 濃縮洗滌液： 1 瓶 × 50mL
- AF-M1稀釋緩沖液: 1 瓶 × 50mL
- 顯色底物液： 1 瓶 ×12mL
- 反應(yīng)終止液： 1 瓶 × 13mL
- 試劑盒說明書
- 質(zhì)控報(bào)告
- 需要的儀器、試劑
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1）儀器
- 酶標(biāo)儀450nm（iELisa全自動(dòng)酶標(biāo)儀或相當(dāng)者）
- 微量移液器：20μL-200μL單道，100μL-1000μL單道, 50μL-300μL八道
- 高速離心機(jī)
- 酶標(biāo)板振蕩器
- 渦旋混合器
- 振蕩器
- 蒸發(fā)設(shè)備、恒溫箱
- 100mL量筒
- 計(jì)時(shí)器
- 天平：感量0.01g
- 離心管1.5mL、50mL
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2）試劑
- 甲醇、正庚烷、二氯甲烷
- 樣品處理
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5.1 牛奶：
- 取牛奶1.0 mL樣品，用離心機(jī)（4000RPM）離心10min.。
- 離心后用移液器徹底去除上層奶油。
- 取200μL下層脫脂牛奶，加入200μLAF-M<蘇b>1稀釋緩沖液（1:1）稀釋。
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稀釋倍數(shù)：2
5.2 酸奶：
- 取酸奶樣品2.0g，用離心機(jī)（4000RPM）離心10分鐘。（如沒有冷凍離心機(jī)，可將樣品先冷卻到10℃，再離心）
- 離心后，取200μL上層澄清液于1.5mL離心管中，加入200μL AF-M<蘇b>1稀釋緩沖液（1:1）稀釋，渦旋混合器混勻。
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稀釋倍數(shù)：2
5.3 奶粉：
- 用天平稱取2.0g奶粉到錐形瓶中，再加入10mL 50℃左右的純水（復(fù)原乳）。
- 用力振蕩3分鐘.，使充分溶解。
- 按照5.1牛奶樣品處理步驟進(jìn)行。
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稀釋倍數(shù)：10 （檢測(cè)范圍：0.5---5 ppb）
5.4 奶粉（高靈敏度）：
- 用天平稱取2.0g奶粉到錐形瓶中，再加入5mL 50℃左右的純水（復(fù)原乳）。
- 用力振蕩3分鐘.，使充分溶解。
- 按照5.1牛奶樣品處理步驟進(jìn)行。
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稀釋倍數(shù)為5（檢測(cè)范圍：0.25---2.5 ppb）
5.5 奶酪：
- 用天平稱取2.0g粉碎的奶酪放入離心瓶中，加入40.0mL二氯甲烷，充分溶解混勻后，劇烈振蕩15分鐘.。
- 過濾，取10.0mL，60℃氮?dú)獯蹈伞?/span>
- 分別加入0.5mL甲醇、0.5mL PBS、1.0mL庚烷，復(fù)容。
- 3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘.。
- 完全去除上層庚烷。
- 取100μL下層提取液于1.5mL離心管中，加入400μL AF-M<蘇b>1稀釋緩沖液（1:4）稀釋，渦旋混合器混勻，取100μL用于檢測(cè)。
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稀釋倍數(shù)：10
6． 酶聯(lián)免疫分析程序
6.1測(cè)定之前注意事項(xiàng)
- 使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。
- 使用后迅速將試劑放入2-8℃冷藏。
- 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測(cè)定程序中的要點(diǎn)。
- 所有溫育過程應(yīng)避免陽(yáng)光直射，并按要求用蓋板覆蓋住酶標(biāo)板。
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6.2溶液的配制
洗滌液的配制：將濃縮洗滌液用純水稀釋10倍后使用。（例如：取10 mL 濃縮液+90 mL純水, 可以用于32孔的檢測(cè)）。
6.3測(cè)定程序
- 將足夠標(biāo)準(zhǔn)品和樣品所用數(shù)量的孔條插入酶標(biāo)板架，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，記錄下標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。未使用的酶標(biāo)板用鋁箔袋封好置2-8℃冷藏保存。
- 分別吸取100μL標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加至相應(yīng)的微孔（雙孔）中,，加蓋，室溫?fù)嵊?/span>50分鐘.。
- 倒出孔中的液體，每孔加入250μL稀釋好的洗滌液，置于酶標(biāo)板振蕩器上振蕩30秒（或者手工振蕩），重復(fù)操作四次。洗完后用力在吸水紙上拍干。
- 每孔加入AF-M<蘇b>1酶標(biāo)抗原100μL，加蓋，室溫?fù)嵊?/span>30分鐘.。
- 倒出孔中的液體，每孔加入250μL 稀釋好的洗滌液，置于酶標(biāo)板振蕩器上振蕩30秒（或者手工振蕩），重復(fù)操作四次。洗完后用力在吸水紙上拍干。
- 每孔加入100μL顯色底物液，加蓋，室溫?fù)嵊?/span>10分鐘.。
- 每孔加入50μL反應(yīng)終止液。
- 置于酶標(biāo)儀中，振蕩混勻，在450nm處測(cè)定吸光度值（OD值），參考波長(zhǎng)630nm。（iELisa全自動(dòng)酶標(biāo)儀可以直接讀出、打印濃度值）
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7. 結(jié)果判定
- 所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以di一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B<蘇b>0）再乘以100%，即百分吸光度值。
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| 百分吸光度值（%）＝ | B | ×100% |
| B<蘇b>0 |
以黃曲霉M1標(biāo)準(zhǔn)品濃度值（ppb）為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計(jì)算出樣本溶液濃度。利用計(jì)算機(jī)專業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析。
- 樣品的實(shí)際濃度為讀數(shù)結(jié)果乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
- 如果測(cè)定值超出檢測(cè)范圍，樣品提取溶液按一定的比例用陰性牛奶樣品進(jìn)行稀釋。
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8. 注意事項(xiàng)
- 室溫低于20℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20- 25℃）會(huì)導(dǎo)致數(shù)值偏低。
- 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥過久的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板排干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
- 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和顯色液對(duì)光敏感，避免直接暴露在光線下。
- 混合要均勻，洗板要徹底（包括加樣品和標(biāo)準(zhǔn)液的時(shí)候都必需充分混合均勻）。
- 反應(yīng)停止液為強(qiáng)酸性物質(zhì)，避免接觸皮膚。
- 不要使用過了有效期的試劑盒，也不要混合使用不同批次的試劑盒，這樣會(huì)引起測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。
- 試劑盒的儲(chǔ)存條件是2-8℃，切勿冷凍。
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9. 檢測(cè)方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度
1）試劑盒靈敏度: 0.05ppb
2）檢測(cè)范圍：牛奶0.1---1.0 ppb
酸奶0.1---1.0 ppb
奶粉0.5---5.0ppb；0.25---2.5 ppb
奶酪0.5---5.0ppb
3）試劑盒變異系數(shù)：小于20%。
4）試劑盒準(zhǔn)確度：回收率范圍在70%-120%之間。
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