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NAD-蘋果酸酶（NAD-ME）測試盒實驗科研

產(chǎn)品說明： ME廣泛存在于微生物、培養(yǎng)細(xì)胞、動物和植物胞漿中，尤其在植物組織中活性較高。ME催化蘋果酸氧化脫 羧的可逆反應(yīng)，產(chǎn)生丙酮酸和CO2，以及伴隨NAD(P)+的還原反應(yīng)，是蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶。ME活性與生物合成 和抗氧化密切相關(guān)。近年來植物ME活性測定較多，已經(jīng)成為抗氧化研究的熱點(diǎn)。根據(jù)輔酶性和對底物特異性 的不同，可將ME分為NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。 NAD-ME催化NAD+還原成NADH，在340nm下測定NADH增加速率。



注意：實驗之建議選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者 增加樣本量進(jìn)行檢測。 需自備的儀器和用品： 紫外分光光度計、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、1mL石英比色皿、研缽/勻漿器、蒸餾水。



NAD-ME 活性計算

1、組織中NAD-ME活力的計算： （1）按樣本蛋白濃度計算： 單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘生成1nmol NADH定義為個酶活力單位。 NAD-ME（U/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10 9]÷(Cpr×V樣) ÷T=965×ΔA÷Cpr （2）按樣本質(zhì)量計算： 單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘生成1nmol NADH定義為個酶活力單位。 NAD-ME（U/g 質(zhì)量）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10 9]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T =965×ΔA÷W

2、細(xì)菌或細(xì)胞中NAD-ME活力的計算： （1）按樣本蛋白濃度計算： 單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘生成1nmol NADH定義為個酶活力單位。 NAD-ME（U/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10 9]÷(Cpr×V樣) ÷T=965×ΔA÷Cpr （2）按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算： 單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘生成1nmol NADH定義為個酶活力單位。 NAD-ME（U/10 4 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10 9]÷(V樣÷V樣總×500) ÷T=1.93×ΔA


3、血清中NAD-ME活力的計算： 單位的定義：每mL血清在反應(yīng)體系中每分鐘生成1nmol NADH定義為個酶活力單位。 NAD-ME（U/mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10 9]÷V樣÷T =965×ΔA V反總：反應(yīng)體系總體積，9×10 -4L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10 3L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.03mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，5min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬；10 9：單位換算系數(shù)，1mol=10 9nmol。

注意事項：

1、 若A2-A1大于0.5，需將樣本用提取液稀釋，使A2-A1小于0.5，可提高檢測靈敏度。

2、 實驗時，樣本在冰上放置，以免變性和失活。試劑在37℃或25℃水浴放置。

3、 在比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持37℃或25℃，取小燒杯只裝入定量的37℃或25℃蒸餾水，將此燒杯放 入37℃或25℃水浴鍋中。在反應(yīng)過程中把比色皿連同反應(yīng)液放入此燒杯中。

4、 好兩個人同時做此實驗，個人比色，個人計時，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

5、 注意：如果ΔA＜0.01，可將反應(yīng)時間延長到10分鐘。