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測定意義：L-半乳糖途徑是合成AsA 的主要途徑。Gal LDH 位于線粒體內膜，負責催化植物體內AsA 生物合成的最后一步，也是該途徑的關鍵酶之一，對植物體內AsA 含量的積累起著至關重要的作用。
測定原理：Gal LDH 催化L-半乳糖內酯還原細胞色素c（Cyt c），還原型Cyt c 在550nm 有吸收峰。測定還原型Cyt c 增加速率，來計算Gal LDH 活性。
自備儀器和用品：臺式離心機、可見分光光度計、1mL 玻璃比色皿、可調式移液器、研缽、冰和蒸餾水。

產品說明： L-半乳糖途徑是合成AsA的主要途徑。Gal LDH位于線粒體內膜，負責催化植物體內AsA生物合成的最后一步， 也是該途徑的關鍵酶之一，對植物體內AsA含量的積累起著至關重要的作用。 Gal LDH催化L-半乳糖內酯還原氧化型細胞色素c（Cyt c），還原型Cyt c在550nm有吸收峰；測定還原型Cyt c 增加速率，來計算Gal LDH活性。 注意：實驗之前建議選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者 增加樣本量進行檢測。 需自備的儀器和用品： 臺式離心機、可見分光光度計、1mL玻璃比色皿、可調式移液器、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟： 一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻） 稱取約 0.1g 樣本，加提取液 1mL，冰上充分研磨，13000g 4℃離心 10min，取上清液置冰上待測。 二、測定步驟 1、 分光光度計預熱30min，調節(jié)波長到550nm，蒸餾水調零。 2、 按樣本數(shù)取出一定量的試劑一在25℃水浴鍋中預熱30min以上，其余的分裝保存(-20℃)。 3、 空白管：依次在1mL比色皿中加入100μL蒸餾水、800μL預熱的試劑一和100μL試劑二，迅速混勻后于550nm比 色，記錄10s和130s的吸光值，分別為A1，A2，ΔA空白管=A2-A1。 4、 測定管：依次在1mL比色皿中加入100μL上清液、800μL預熱的試劑一和100μL試劑二，迅速混勻后于550nm比 色，記錄10s和130s的吸光值，分別為A3，A4，ΔA測定管=A4-A3。 三、Gal LDH 活性計算 （1）按蛋白濃度計算 Gal LDH活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘還原1μmol Cyt c為1個酶活單位。 Solarbio Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd Tel: 400-968-6088 Fax: 010-56371281/82 Http://www.solarbio.com第 2 頁，共 2 頁 Gal LDH (U/mg prot) = [(ΔA測定管-ΔA空白管)÷ε÷d×V反總×10 6]÷（Cpr×V樣）÷T =0.289×(ΔA測定管-ΔA空白管) ÷Cpr （2）按樣本質量計算 Gal LDH活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘還原1μmol Cyt c為1個酶活單位。 Gal LDH（U/g 質量）=[(ΔA測定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反總×10 6]÷(V樣÷V樣總×W)÷T =0.289×(ΔA測定管-ΔA空白管) ÷W ε：還原型Cyt c摩爾消光系數(shù)，17.3×10 3L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應體系總體積，1mL=0.001L； 10 6：單位換算系數(shù)，1mol=1×10 6μmol；V樣：加入反應體系中上清液體積，100μL=0.1mL；V樣總：提取液體積， 1mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，蛋白質濃度需要另外測定；W：樣本質量，g；T：反應時間，2min。